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山茱萸（Cornus officinalis Sisb. Et Zucc.）又名棗皮，是山茱萸科山茱萸的干燥果肉，具有降低血壓，抗氧化，抗癌的功效，可以補(bǔ)益肝腎，澀精固脫，其有效成分為馬錢(qián)苷，熊果酸等^[1]。山茱萸主要分布在陜西，河南，四川等地^[2]。

馬錢(qián)苷是一種萜苷類(lèi)化合物，在調(diào)節(jié)免疫，預(yù)防心血管疾病方面具有有效作用^[3-4]。鑒于現(xiàn)行2010版《中國(guó)藥典》以馬錢(qián)苷作為含量測(cè)定指標(biāo)，以控制山茱萸藥材質(zhì)量，且目前關(guān)于提取分離馬錢(qián)苷的文獻(xiàn)報(bào)道鮮少。制備型高效液相色譜（Pre-HPLC）作為一種高效的分離純化技術(shù)，有著分離效率高，單次分離時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)。為更深層次利用山茱萸等中藥材，控制相關(guān)藥品質(zhì)量，我們采用Pre-HPLC法，運(yùn)用本實(shí)驗(yàn)室裝填的動(dòng)態(tài)軸向壓縮色譜柱，從中藥山茱萸中分離高純度的馬錢(qián)苷。

1  實(shí)驗(yàn)方法

1.1  儀器

制備型高壓高效液相色譜柱（ID63×630mm）、動(dòng)態(tài)軸向加壓液壓站：聊城萬(wàn)合工業(yè)制造有限公司；制備高壓輸液泵：GLP3250；紫外—可見(jiàn)檢測(cè)器：UC-3292；Rheodyne3725i六通進(jìn)樣閥（配5ml定量環(huán)）；色譜工作軟件及電腦。高效液相色譜儀，高速離心機(jī)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。

1.2  試劑與試藥

二次重蒸水；甲醇，乙腈（均為工業(yè)級(jí)，使用前先經(jīng)過(guò)整流處理再用孔徑為0.45μm的微孔濾膜過(guò)濾）；薄層色譜硅膠、柱色譜硅膠、球形硅膠（富士硅化學(xué)有限公司）；大孔吸附樹(shù)脂；山茱萸藥材購(gòu)自河南；馬錢(qián)苷對(duì)照品（99%含量）。

1.3樣品的處理

將山茱萸藥材粉碎，稱(chēng)取粉末4kg，加入6倍量的95%乙醇浸泡24小時(shí)，回流提取2次，每次2h，濾過(guò)，合并濾液，濾液回收乙醇，減壓濃縮至無(wú)乙醇味。濃縮液用離心機(jī)以10000rpm的轉(zhuǎn)速離心3min，取上層澄清液，即為山茱萸提取液。

1.4大孔樹(shù)脂富集苷類(lèi)

取大孔吸附樹(shù)脂1kg，乙醇浸泡3d，傾去上浮物，濕法裝柱。用乙醇清洗，至流出液與水混合不呈現(xiàn)白色乳濁現(xiàn)象即可，然后用大量蒸餾水清洗柱中乙醇，水浸泡備用。將1.3節(jié)山茱萸提取液吸附于大孔樹(shù)脂柱，用6000ml蒸餾水、30%乙醇約15000ml依次洗脫，將乙醇洗脫部分濃縮，浸膏備用。

1.5硅膠柱色譜純化

硅膠（100-200目）2kg,濕法裝柱，取1.4節(jié)所得浸膏與等量硅膠的拌料，上樣，柱色譜分離，用氯仿-甲醇溶劑系統(tǒng)以體積比15:1，12:1，9:1，6:1，3:1梯度洗脫，收集氯仿-甲醇9:1的餾分，減壓濃縮后過(guò)濾，得白色固體。

1.6高效型液相色譜純化

液相色譜制備條件：球形硅膠填料（ID63×630mm）：流動(dòng)相：甲醇-水（體積比38:62）；流速：150ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：236nm。

稱(chēng)取2kg硅膠加入3000ml甲醇超聲，攪拌30min脫氣，將攪拌好的硅膠緩慢注入柱體內(nèi)，沉降30min，裝好柱頭密封元件，軸向加壓壓縮柱床至出液管無(wú)液體流出。將1.5所得白色固體溶解于甲醇-水（38:62）中，抽取10-15ml經(jīng)針式濾膜過(guò)濾，舍棄初濾液，續(xù)濾液收集至潔凈容器中備用。手動(dòng)進(jìn)樣針進(jìn)樣。收集保留時(shí)間為7.5min的組分，見(jiàn)圖1。收集液干燥后得白色晶體。

2  結(jié)果測(cè)定

2.1  結(jié)構(gòu)確定

馬錢(qián)苷：白色晶體，易溶于甲醇、水。¹³C-NMR（500MHz，CD₃SOCD₃）δ：168.245（11-C），150.985（3-C），112.856（4-C），97.526（1’-C），96.459（1-C），75.896(5’-C)，75.125(3’-C)，73.985(7-C)，72.563(2’-C)，69.103(4’-C)，60.142(6’-C)，51.871(12-C)，44.328(9-C)，39.523(6-C)，39.103(8-C)，29.623(5-C)，10.985(10-C)，NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道^[5]一致，結(jié)構(gòu)確定為馬錢(qián)苷。

2.2 定性測(cè)定

將所得的馬錢(qián)苷在硅膠板上點(diǎn)樣，馬錢(qián)苷對(duì)照品溶液作對(duì)照，氯仿—甲醇為展開(kāi)劑，晾干，硫酸溶液為顯色劑，吹風(fēng)機(jī)吹干，馬錢(qián)素樣品為與對(duì)照溶液相同的紫紅色斑點(diǎn)，Rf值為0.52。

2.3 定量測(cè)定

將馬錢(qián)苷對(duì)照品準(zhǔn)確稱(chēng)取5mg，用甲醇配制成0.05mg/ml的溶液100ml，作為對(duì)照品溶液。

精密稱(chēng)取制得的馬錢(qián)苷單體25mg，加甲醇-水鹽酸（體積比30:70）混合液25ml，轉(zhuǎn)移至50ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，用微孔濾膜（0.5μm ）濾過(guò)待用。

高效液相色譜分析條件：C18（ID4.6×250mm）：流動(dòng)相：甲醇-水（體積比30:70）；流速：1.0ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：236nm。在此色譜條件下，馬錢(qián)苷對(duì)照品為一個(gè)主峰，歸一化面積百分比達(dá)98%以上

3討論

現(xiàn)代研究表明，馬錢(qián)苷為山茱萸中的主要活性成分，為藥典^[2]中控制其藥材質(zhì)量以及相關(guān)中成藥質(zhì)量的指標(biāo)成分。用上述制備方法進(jìn)行提取、分離、純化，操作方便，重現(xiàn)性好，符合對(duì)照品的純度要求，因而可作為對(duì)照品使用。

根據(jù)山茱萸中主要活性成分—馬錢(qián)苷的理化性質(zhì)，在提取純化工藝中，采用大孔吸附樹(shù)脂精制苷類(lèi)，大大提高了馬錢(qián)苷的富集量，除去大量雜質(zhì)。富集后的樣品通過(guò)硅膠柱色譜進(jìn)一步分離純化，可得到馬錢(qián)苷粗品。粗品通過(guò)制備型高效液相色譜再次處理純化，從核磁共振譜圖，薄層色譜圖，分析型高效液相色譜圖，可確定樣品結(jié)構(gòu)，純度符合標(biāo)準(zhǔn)，可作為對(duì)照品。

參考文獻(xiàn)

[1]  中華本草. 國(guó)家中醫(yī)藥管理局中華本草編輯委員會(huì),1999

[2]  國(guó)家藥典委員會(huì)編. 山茱萸. 中華人民共和國(guó)藥典（1部）. 北京：化學(xué)工業(yè)出版社,2010:26

[3]  謝宗萬(wàn). 全國(guó)中草藥匯編（上冊(cè)）[M].北京：人民衛(wèi)生出版社,1975.

[4]  孫文基、謝世昌主編. 天然藥物成分定量分析,中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2003年1月，第一版

[5]  劉錚等. 化學(xué)世界. 1996,（7）：355-358

[6]  沙世炎等. 中草藥有效成分分析法