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制備型液相色譜法分離千層塔中石杉?jí)A甲
2014-09-02查看:
采用高效液相色譜技術(shù)，分離制備千層塔中石杉?jí)A甲。制備色譜條件：色譜柱（ID63×700mm，Diam...
趙新燕
（聊城萬合工業(yè)制造有限公司，山東 聊城252022）
石杉?jí)A甲(Huperzine A)是從石杉科植物千層塔[Huperziaserrata(Thumb.)Trev(又名蛇足石杉)]中分離得到的生物堿。它是一種強(qiáng)效、低毒的可逆性乙酰膽堿酯酶抑制劑[1-3]，可用來治療重癥肌無力、跌打損傷和老年癡呆等癥[4-5]。石杉?jí)A甲片劑已通過衛(wèi)生部審批，在國(guó)內(nèi)出售并部分出口國(guó)外[6]。
石杉?jí)A甲治療指數(shù)很高[7-9]，但在天然產(chǎn)物中的含量很低。傳統(tǒng)的提取工藝是將生藥通過溶劑萃取，上柱層析分離，重結(jié)晶等工序。所要求的技術(shù)含量高，要經(jīng)過多次層析，反復(fù)重結(jié)晶，才能達(dá)到較高純度，產(chǎn)量低，條件不易控制，周期長(zhǎng)，成本高。本文采用制備型高效液相色譜分離了石杉?jí)A甲，分離工藝簡(jiǎn)單，提取率高，所得石杉?jí)A甲質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高（90%以上），為進(jìn)一步利用制備型高效液相色譜法工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)石杉?jí)A甲提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
1 實(shí)驗(yàn)部分
1.1 儀器
高效液相色譜儀含GLP3250泵，可更換泵頭兩個(gè)（250ml）,GLP色譜工作軟件，UC-3292檢測(cè)器；超聲清洗機(jī)，PH測(cè)定儀。
1.2 試劑與試藥
氯仿，甲醇，氨水，硫酸，氫氧化鈉，純水（均為分析純）；石杉?jí)A甲對(duì)照品（99.1%含量）；千層塔來源于重慶，經(jīng)鑒定符合中華人們共和國(guó)藥典（2010版）規(guī)定。
1.3 色譜條件
分析條件：色譜柱（ID4.6×250mm，C18,粒徑5μm）；流動(dòng)相：甲醇—水（85：15）；流速：1ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：231.3nm；進(jìn)樣體積10μl。
制備條件：色譜柱（ID63×700mm，Diamonsil C18,粒徑25~40μm）；流動(dòng)相：氯仿—甲醇—氨水（840：24:1.2）；流速：40ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：311nm；進(jìn)樣體積5ml。
1.4 樣品的處理
取藥材粉碎，過20目篩，取干燥的千層塔粗粉1.6kg，加入10倍體積的PH為1的硫酸溶液，浸泡一段時(shí)間12小時(shí)，超生浸提幾分鐘，提取幾次，合并酸液；加氫氧化鈉溶液調(diào)PH至9，再加氯仿反復(fù)提取，并濃縮至膏。
1.5 石杉?jí)A甲的制備
將按照1.4節(jié)方法制備的石杉?jí)A甲固體提取物用制備色譜的流動(dòng)相配制成體積為10mL的溶液，用孔徑為0.45 μm的濾膜過濾，作為制備液。在1.3節(jié)制備色譜條件下開機(jī)，待基線穩(wěn)定后進(jìn)樣，收集相應(yīng)餾分，經(jīng)蒸發(fā)濃縮，結(jié)晶即可，得石杉?jí)A甲晶體。
1.6 制備樣品的質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定
精密稱取按照1.5節(jié)制得的石杉?jí)A甲2mg，用分析色譜流動(dòng)相定容于10mL容量瓶中。按照石杉?jí)A甲含量測(cè)定方法[10]對(duì)所制得的樣品進(jìn)行石杉?jí)A甲純度檢測(cè),符合質(zhì)量要求。
2 結(jié)果與討論
2.1 流速對(duì)分離石杉?jí)A甲的影響
將分析型液相色譜按比例擴(kuò)大為制備型液相色譜時(shí)，盡可能使制備柱的固定相類型、溶劑組分等方面與分析柱保持一致，通常柱長(zhǎng)保持大體相同，以增加柱徑來達(dá)到更大的柱容量，這樣，只考慮流速問題，可以從下面關(guān)系近似得到最大流速：
制備柱流速=×分析柱流速
根據(jù)石杉?jí)A甲制備條件中流速大小[11],結(jié)合上式，計(jì)算得出大流速為79.38 ml/min。
稱取粉碎干燥的千層塔粗粉1.6kg（共7份），按照1.4和1.5節(jié)操作，以氯仿—甲醇—氨水（840：24:1.2）為流動(dòng)相，考察不同流速對(duì)石杉?jí)A甲分離效果的影響，結(jié)果見表1。
表1可知：隨著流速的增大，石杉?jí)A甲的保留時(shí)間逐漸減小，分離度降低，柱壓升高；隨著流速減小，保留時(shí)間延長(zhǎng)，分離度增大，但流速太小時(shí)，保留時(shí)間過長(zhǎng)，且色譜峰變寬；流速的變化對(duì)石杉?jí)A甲純度的影響不是很大，所以為了縮短分離時(shí)間，且保持良好的分離度，選擇流動(dòng)相的流速為40ml/min。
2.2 進(jìn)樣質(zhì)量濃度對(duì)分離石杉?jí)A甲的影響
分別稱取粉碎、過篩、干燥的千層塔粗粉1000、1200、1400、1600、1800g，按照1.4和1.5節(jié)進(jìn)行操作，考察了進(jìn)樣質(zhì)量濃度對(duì)分離石杉?jí)A甲的影響，結(jié)果見表2。
表1 流動(dòng)相的流速對(duì)分離石杉?jí)A甲的影響
|
流動(dòng)相的流速 /(ml/min) |
保留時(shí)間 /min |
分離度 /R |
石杉?jí)A甲的 質(zhì)量分?jǐn)?shù) w(Huperzine A)/% |
柱壓 /MPa |
|
10 |
28 |
>1.5 |
92.4 |
3.1～3.4 |
|
20 |
16 |
>1.5 |
92.2 |
6.2～6.5 |
|
30 |
13 |
>1.5 |
92.3 |
9.2～9.5 |
|
40 |
10 |
>1.5 |
92.1 |
12.4～12.9 |
|
50 |
7 |
<1.5 |
90.8 |
14.6～15.3 |
|
60 |
5 |
<1.5 |
91.2 |
18.5～19.2 |
|
70 |
3 |
<1.5 |
89.8 |
22.1～22.7 |
由表2可知：隨著進(jìn)樣質(zhì)量濃度增大，保留時(shí)間逐漸增大，分離度降低，洗脫時(shí)間延長(zhǎng)，所得石杉?jí)A甲的質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低；進(jìn)樣質(zhì)量濃度低時(shí)分離度較高，洗脫時(shí)間較短，所得石杉?jí)A甲的質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，但生產(chǎn)效率下降。為保證所制石杉?jí)A甲既有較高的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，又有較高的生產(chǎn)效率，選擇進(jìn)樣質(zhì)量濃度為160g(生藥材)/mL。
2.3 進(jìn)樣量體積對(duì)分離石杉?jí)A甲的影響
稱取粉碎、過篩、干燥的千層塔粗粉1600g（共6份），按照1.4節(jié)進(jìn)行操作，得6份石杉?jí)A甲固體提取物，分別用制備色譜條件中的流動(dòng)相配置成體積為2、3、4、5、6、7ml的制備樣品溶液，用孔徑為0.45 μm的濾膜過濾，得制備液。按1.3節(jié)制備色譜條件進(jìn)行純化分離，考察了進(jìn)樣質(zhì)量體積對(duì)分離石杉?jí)A甲的影響，結(jié)果見表3。
表2 進(jìn)樣質(zhì)量濃度對(duì)分離石杉?jí)A甲的影響
|
進(jìn)樣質(zhì)量濃度 /[g(生藥材)/ml] |
保留時(shí)間 /min |
分離度 /R |
石杉?jí)A甲的 質(zhì)量分?jǐn)?shù) w(Huperzine A)/% |
|
100 |
2 |
>1.5 |
92.7 |
|
120 |
2 |
>1.5 |
92.5 |
|
140 |
3 |
>1.5 |
92.6 |
|
160 |
7 |
>1.5 |
92.3 |
|
180 |
9 |
<1.5 |
91.8 |
表3 進(jìn)樣量體積對(duì)分離石杉?jí)A甲的影響
|
進(jìn)樣量體積 /(ml) |
保留時(shí)間 /min |
分離度 /R |
石杉?jí)A甲的 質(zhì)量分?jǐn)?shù) w(Huperzine A)/% |
|
2 |
3 |
<1.0 |
89.4 |
|
3 |
5 |
<1.0 |
90.2 |
|
4 |
6 |
<1.5 |
90.8 |
|
5 |
7 |
>1.5 |
92.1 |
|
6 |
9 |
>1.5 |
92.3 |
|
7 |
10 |
<1.5 |
90.2 |
由表3可知：隨著進(jìn)樣體積增大，石杉?jí)A甲質(zhì)量分?jǐn)?shù)先增大又減小，分離度先增大后減小，保留時(shí)間逐漸增大，當(dāng)進(jìn)樣體積大于7mL后，色譜分辨率降低，洗脫時(shí)間延長(zhǎng)，所得冬凌草甲素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低。進(jìn)樣體積不能太小，否則色譜分辨率太低，冬凌草甲素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低。綜合考慮，要分離制得質(zhì)量分?jǐn)?shù)高的產(chǎn)品，進(jìn)樣體積以5mL較好。
2.4 石杉?jí)A甲質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)量結(jié)果
按照上述2.1-2.3節(jié)確定的條件分離制備了8批石杉?jí)A甲樣品，按照1.6節(jié)條件測(cè)定其質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見表4，表中數(shù)據(jù)均為3次測(cè)定結(jié)果的算術(shù)平均值。
表4 石杉?jí)A甲質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定結(jié)果
|
批號(hào) |
w(Huperzine A)/% |
相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（%） |
|
1 |
92.3 |
1.3 |
|
2 |
92.1 |
0.9 |
|
3 |
92.3 |
1.2 |
由表4可知，采用制備型高效液相色譜法所制得的石杉?jí)A甲的質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，均能達(dá)到Huperzine A的純度大于90%的技術(shù)要求。
3 結(jié)論
我們用制備型高效液相色譜法制備分離石杉?jí)A甲。1.6kg千層塔可以得到近320mg的Huperzine A，重復(fù)性好，產(chǎn)品純度達(dá)到了技術(shù)要求。本方法成本低，可為工業(yè)化生產(chǎn)工藝提供參考。
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